fondazione teresa & luigi de beaumont BONELLI onlus

per le ricerche sul cancro

  • Fondazione Teresa e Luigi de Beaumont per le ricerche sul cancro

BORSE DI STUDIO

Ruolo di TLP (Tumor Liberated Protein) nel cancro al polmone

Cosa finanziamo

Il cancro al polmone è la principale causa di morte per cancro nei paesi occidentali. L'elevata mortalità è attribuibile sia alla diagnosi tardiva che alla mancanza di trattamenti efficaci. È quindi fondamentale l’identificazione di nuovi marcatori molecolari, utili sia per la diagnosi precoce sia per l’ideazione di nuove strategie terapeutiche mirate. A tale scopo, sono in corso studi volti alla caratterizzazione di una proteina precedentemente identificata, facente parte di un complesso proteico definito TLP (tumor liberated protein), che potrebbe rappresentare un nuovo marcatore sensibile e affidabile per la diagnosi precoce del tumore polmonare (NSCLC, non-small cell lung cancer) mediante prelievo di sangue. Inoltre, a causa della sua specifica attività immunogenica, TLP potrebbe anche rappresentare un possibile candidato per sviluppare un vaccino anticancro.

Nuove strategie per lo studio e la cura del mesotelioma maligno

Nuove strategie per lo studio

Il mesotelioma maligno (MM) è un tumore molto aggressivo, il cui principale fattore di rischio è l’esposizione all’asbesto. Negli ultimi anni il MM ha destato grande preoccupazione a causa della sua crescente incidenza in tutto il mondo. Per il MM non esistono modalità curative ed è quindi urgente lo sviluppo di metodi per la diagnosi precoce e di terapie mirate. A tale scopo, stiamo studiando i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo del MM e, parallelamente, stiamo valutando nuovi approcci di terapia molecolare, utilizzando agenti che agiscano selettivamente sulle specifiche alterazioni molecolari del MM.

BORSA DI STUDIO PRESSO L'UNIVERSITA' DI SIENA ANNO 2012 EURO 19.367,00

Nuovi inibitori delle chinasi della famiglia di SRC come potenziali candidati per la terapia degli astrocitomi maligni.

Gli astrocitomi maligni, che includono il glioblastoma, sono i tumori intracranici più comuni e letali. Nonostante i recenti progressi nella classificazione molecolare, nelle tecniche chirurgiche, nella radioterapia e l'integrazione con nuove e mirate terapie, la sopravvivenza dei pazienti con astrocitoma maligno rimane bassa. Quindi, è necessario sviluppare nuove strategie terapeutiche. Recenti studi indicano che le chinasi della famiglia di SRC (SFK) sono spesso attivate sia in linee cellulari che in tessuti di astrocitoma, suggerendo che queste chinasi potrebbero essere importanti target terapeutici negli astrocitomi. In particolare, la de-regolazione delle SFK si è dimostrata essere alla base dei meccanismi di proliferazione cellulare, migrazione e sopravvivenza cellulare.

Obiettivo

Il nostro obiettivo è definire, a livello preclinico, se i nuovi inibitori di SFK a struttura pirazolo-pirimidinica, che si sono dimostrati ottimi agenti antiproliferativi e pro-apoptotici in diversi tipi tumorali, possano essere agenti antitumorali utili anche per gli astrocitomi.

Piano sperimentale

Valuteremo l’attività antiproliferativa di nuovi inibitori di SFK a struttura pirazolo-pirimidinica in diverse linee di astrocitoma (T98G, U87, HU2, U373) con il saggio MTS.
Verificheremo che le nostre molecole inibiscano l’attivazione di SFK nelle linee di astrocitoma, valutando l’espressione della forma attiva fosforilata dopo il trattamento.
Per saggiare la selettività di questi composti verso i membri della famiglia SFK, testeremo queste molecole contro un pannello di diverse chinasi.
Per escludere la potenziale tossicità in cellule non tumorali, analizzeremo gli effetti di queste molecole in cellule non neoplastiche.
Realizzeremo il saggio di formazione delle colonie per valutare se i nostri inibitori di SFK siano in grado di esercitare un’inibizione a lungo termine della crescita delle cellule di astrocitoma.
L’analisi citofluorimetrica e il saggio delle caspasi verranno realizzati per verificare la possibile induzione di apoptosi.
Analizzeremo i meccanismi molecolari alla base degli effetti degli inibitori di SFK valutando l’espressione delle proteine coinvolte nella regolazione dell’apoptosi e nel ciclo cellulare, tramite western blot e real-time PCR quantitativa.
Inoltre proponiamo di studiare gli effetti di questi inibitori nell’invasione cellulare con saggi di invasione su matrigel.
Infine, l’efficacia degli inibitori di SFK verrà comparata a quella dei convenzionali agenti chemioterapici e del PP2, un noto inibitore di SFK.
Elisa Ceccherini
Genetics, Oncology and Clinical Medicine – GenOMeC
Oncological Genetics
XXVII cycle
Borsa di studio presso l’Università di Siena anno 2013 Euro 3117,00

Applicazione di oligosaccaridi legati a nano-particelle d’oro per la terapia del tumore alla mammella.

La glicosilazione aberrante è un fenomeno comune associato alle trasformazioni oncogeniche. Il fenomeno comprende sia la sintesi incomplete con accumulazione precoce sia la neosintesi di strutture anomale che risultano nell’accumulazione di alcuni carboidrati in alta densità sulla superficie delle cellule tumorali. In particolare, è stato dimostrato che durante la trasformazione oncogenica (1) avvengono cambiamenti quantitativi e qualitativi nell’espressione dei gangliosidi. Le trasformazioni maligne sembrano attivare enzimi coinvolti nella glicosilazione dei gangliosidi che portano ad un’alterazione dei gangliosidi presenti nelle cellule tumorali. La maggior parte dei melanomi contengono principalmente i gangliosidi GM3 e GD3. I gangliosidi GM2, GD2, O-acetil-GD3, O-acetil-GD2 e GT3 sono stati trovati in altri tipi di tumori e linee cellulari. Allo stesso modo, i neuroblastomi contengono GM3, GM2 e GD2 come gangliosidi predominanti, mentre astrocitomi e gliomi sintetizzano una grande varietà di gangliosidi. Il modello gangliosidico del melanoma umano è considerato di notevole interesse. I melanociti normali contengono prevalentemente il ganglioside GM3, mentre il GD3 aumenta in seguito alla trasformazione neoplastica. Per questa ragione, mentre il melanoma progredisce nelle variazioni metastatiche, c’è una differenza pronunciata nel rapporto GM3:GD3. Benché questi antigeni siano presenti anche in tessuti normali, nei tumori essi sono presenti in alti tassi e con una diversa organizzazione e conformazione a livello di superficie cellulare tumorale. Anche se un particolare ganglioside è presente nella membrana plasmatica, esso potrebbe non essere necessariamente accessibile per una reattività immunitaria, fino a che la reattività di un dato antigene gangliosidico non viene fortemente influenzata dalla presenza di altri gangliosidi nella membrana stessa. La spiegazione di questo fenomeno potrebbe risiedere nella diversa organizzazione dei glicolipidi nella membrana cellulare, un problema complesso che è ancora solo in parte compreso. Una spiegazione potrebbe essere che i ganglosidi più complessi abbiano un orientamento più verticale mentre altri potrebbero assumere un orientamento più orizzontale e, quindi, avere una localizzazione meno accessibile sulla superficie cellulare. Alcuni anticorpi possono riconoscere i gangliosidi solo quando questi sono presenti in un’alta densità sulla superficie cellulare, come è stato mostrato per l’anticorpo anti-GM3. Un ulteriore esempio di questo è rappresentato dal ganglioside GD3, che nel melanoma presenta un ceramide contenente un acido grasso a lunga catena, a differenza del GD3 presente nei tessuti cerebrali normali che ha un acido grasso a catena corta. Nel melanoma la specie molecolare del GD3 contenente l’acido grasso a catena lunga è nota per essere più immunogenica. Generalmente, i gangliosidi purificati sono poco immunogenici, ma in alcune circostanze sembrano essere più immunogenici del resto della cellula. Per ottenere una risposta immunitaria contro i gangliosidi purificati, essi generalmente devono essere accoppiati a delle proteine o incorporati in liposomi. Una peculiarità della risposta degli anticorpi nei confronti dei gangliosidi è che l’isotipo predominante dell’immunoglobulina è solitamente l’IgM, che generalmente non è ben adatto per la maggior parte delle applicazioni diagnostiche e terapeutiche. Sebbene gli anticorpi antigangliosidi del tipo IgG siano stati trovati sia nei topi sia negli esseri umani, la partecipazione dei linfociti T generalmente sembra essere non specifica e indotta dall’adiuvante. Questo si traduce in una risposta anticorpale di breve durata e in una bassa affinità degli anticorpi tipiche degli antigeni indipendenti dalle cellule T. Di conseguenza, un problema fondamentale da superare è l’incremento dell’immunogenicità dei gangliosidi e allo stesso tempo cercare di coinvolgere le cellule T in modo da scatenare una risposta anticorpale secondaria e portare alla produzione di anticorpi IgG ad alta affinità. I gangliosidi associati al melanoma sono considerati di notevole importanza per la loro particolare distribuzione nel normale tessuto cellulare. L’importanza dei gangliosidi come targets per immunoterapie passive e attive è stata documentata attraverso studi clinici osservati dopo il trattamento di pazienti con anticorpi anti-GD2, anti-GD3 e anti-GM2 e nei protocolli di vaccinazione attraverso la correlazione tra la produzione di anticorpi e il miglioramento della prognosi dopo l’immunizzazione con vaccini GM2.

L’immunizzazione dei pazienti con vaccini costituiti da cellule di melanoma con cellule di melanoma hanno portato alla generazione degli anticorpi anti-GM2 e degli anticorpi anti-GD2, ma non degli anticorpi anti-GM3 e anti-GD3. Tutti questi anticorpi sono però anticorpi IgM. Nei protocolli di vaccinazione con le frazioni totali dei gangliosidi isolati dalle cellule di melanoma, la risposta umorale provocata dal vaccino gangliosidico è stata di tipo IgG. Le differenze trovate rispetto alla precedente sperimentazione potrebbe essere dovuta alle differenze nei protocolli di immunizzazione. Nonostante siano stati trovati gli anticorpi contro tutti i gangliosidi iniettati nonostante questi reagissero con le cellule tumorali maligne, il titolo degli anticorpi antigangliosidi era basso. Alcuni gangliosidi possono essere definiti degli antigeni tumorali specifici. La presenza di strutture contenenti acido N-glicolilneuraminico (anche chiamate antigeni Hanganutziu-Deicher, una variante di acido sialico non trovato nei normali esseri umani) sono stati trovati in alcuni tumori. Altri studi hanno anche descritto anticorpi glicolipidici antieterofili nei sieri umani. Sono stati anche trovati elevati livelli di entrambi gli anticorpi IgM e IgG contro le strutture contenenti l’acido N-glicolilneuraminico nei sieri da pazienti con melanoma, ma la presenza delle strutture corrispondenti negli estratti glicolipidici dai tumori melanoma sembrano essere controversi. La presenza ricorrente di antigeni gangliosidici associati ai tumori con attività antigenica di tipo Hanganutziu-Deicher sui melanoma umani sono stati riportati in letteratura. La struttura O-Ac-GD3 nel melanoma umano è generalmente considerato essere melanoma specifico. La selettività e la specificità degli anticorpi umani li rende dei promettenti reagenti per la terapia del cancro umano e per l’imaging. Essi possono essere direttamente citotossici attraverso l’interazione della loro porzione Fc con complementi o cellule citotossiche. Alternativamente, gli anticorpi umani possono agire da carrier di agenti citotossici quando sono associati a radioisotopi, tossine naturali agenti chemioterapici o cellule citotossiche. Le difficoltà tecniche nella produzione di anticorpi umani, ha fortemente limitato l’attuale esperienza clinica con le nuove classi di reagenti, ma un clinical trial sembra essere molto promettente: l’iniezione intra-tumorale di anticorpi IgM contro il ganglioside GD2 produce la regressione del melanoma in 6 degli 8 pazienti trattati, e una regressione completa del tumore in un paziente, senza recidive nei successivi 20 mesi. Inoltre non sono stati notati effetti collaterali e una risposta anti-idiotipo osservata in 5 pazienti non a compromesso il trattamento. Anche l’imaging ha avuto notevoli successi in alcuni casi, nonostante l’immunoscintigrafia non sia diventata un metodo di routine nello screening di pazienti con il cancro. Per quanto riguarda gli studi di imaging con anticorpi umani diretti contro gli antigeni gangliosidi, in letteratura è stato riportato uno studio pilota che usa IgM umane radiomarcate con 111Indio per l’imaging di metastasi del cancro al seno.

Nuovi metodi per generazione di anticorpi umani specifici con alta affinità per gli antigeni gangliosidici, basati sull’uso di nuovi derivati gangliosidici immunogenici potranno senza dubbio aumentare la possibilità di generare anticorpi umani di alta qualità e aumentare anche la possibilità di produrre reagenti migliori per la diagnosi e il trattamento di diversi tipi di tumore. Questo progetto sperimentale mira alla produzione di antigeni glicolipidici immunogenici che contengono strutture oligosaccaridiche associate alle cellule tumorali. Questo potrebbe essere utilizzato per produrre anticorpi monoclonali di alta affinità di tipo IgG.

Come antigeni glicolipidici sarei interessata alla sintesi di glicopolimeri anfifilici per le seguenti ragioni: i glicopolimeri anfifilici di elevata massa molecolare e dimensione potrebbero essere immunogeniche; a causa dell’effetto idrofobico, la porzione idrofobica del glicopolimero è inaccessibile all’acqua, essendo il glicopolimero solubile nel siero; alcuni polimeri sono noti per non essere tossici; il numero di catene oligosaccaridiche e la loro densità possono essere progettati per mimare i domini di membrana arricchiti in sfingolipidi delle cellule tumorali; le catene oligosaccaridiche possono essere mischiate con strutture che possono promuovere la risposta dei linfociti T. Questo progetto sperimentale si è focalizzato sulla produzione di antigeni glicolipidici immunogenici che contengono strutture oligosaccaridiche associate alle cellule tumorali. Questo potrebbe essere utilizzato per produrre anticorpi monoclonali di alta affinità di tipo IgG utili per diagnosi e il follow-up di diversi tipi di tumore e per la produzione in situ di anticorpi citotossici per il trattamento del tumore. Come antigeni glicolipidici mi sono interessata alla sintesi di glicopolimeri anfifilici per le seguenti ragioni: i glicopolimeri anfifilici di elevata massa molecolare dimensione potrebbero essere immunogeniche; a causa dell’effetto idrofobico, la porzione idrofobica del gli copolimero è inaccessibile all’acqua, essendo il glicopolimero solubile nel siero; alcuni polimeri sono noti per non essere tossici; il numero di catene oligosaccaridiche e la loro densità possono essere progettati per mimare i domini di membrana arricchiti in sfingolipidi delle cellule tumorali; le catene oligosaccaridiche possono essere mischiate con strutture che possono promuovere la risposta dei linfociti T. Le procedure per preparare i polimeri sono state sviluppate a partire dagli oligosaccaridi derivanti da glicoconiugati naturali (1-2) e i mimi degli oligosaccaridi sintetici (3-5). La caratterizzazione strutturale dei composti naturali delle loro catene oligosaccaridiche, degli intermedi di reazione e dei glicopolimeri è stata determinata con la spettroscopia nmr (6-10) e la spettroscopia di massa (11-12). La massa molecolare dei glicopolimeri è stata determinata da misure light scattering (13-26). In fututo le proprietà immunogeniche dei composti sintetizzati saranno studiati con approci biochimici ed immunochimici.

Il progetto sperimentale ha compreso:

Sintesi dell’antigene oligosaccaridico:

a-Neu5Ac-(2-3)-b-Gal-(1-4)-Glc
a-Neu5Gc-(2-3)-b-Gal-(1-4)-Glc
a-Neu5Ac-(2-8)-a-Neu5Ac-(2-3)-b-Gal-(1-4)-Glc
b-Gal-(1-3)-b-GalNAc-(1-4)-[a-Neu5Ac-(2-3)]-b-Gal-(1-4)-Glc
b-Gal-(1-3)-b-GalNAc-(1-4)-[a-Neu5Gc-(2-3)]-b-Gal-(1-4)-Glc ed i loro mimici.

Sintesi di antigeni glicopolimeri anfifilici . gold nanoparticles di oligosaccaride GM3NeuGc.
Produzione di anticorpi antioligosaccaridici monoclonali.
Caratterizzazione di specificità ed affinità degli anticorpi per antigeni sialiloligosaccaridici.

Più in dettaglio, la ricerca è stata sviluppata secondo le seguenti fasi:

Gangliosidi. Tutti i lipidi vengono estratti dal cervello di maiale ed i gangliosidi purificati con il partizionamento.
Ganglioside GM1. Il ganglioside GM1, che contiene l’acido N-acetilneuramminico, viene preparato da una miscela di gangliosidi sottoposta a processo enzimatico della sialidasi. Tale processo dà come resa una miscela che contiene il 95% di GM1 ed in minor percentuale una serie di composti secondari(23). Il GM1 viene poi purificato tramite cromatografica su colonna con gel di silice. Una parte del GM1 viene idrolizzato sotto condizioni alcaline per dare GM1 contenente acido neuramminico (Neu). Tale prodotto trattato con il 1,3-dioxalan-2,4-dione dà come prodotto finale il GM1 contenente l’acido N-glicolilneuramminico (24).
Sintesi dei gangliosidi lattoni. La Miscela totale di gangliosidi e tutte le specie di GM1 sono lattonizzate con dicicloesilcarbodiimmide in dimetilsolfossido (1, 25).
Gangliosidi GM3 e GD3. I gangliosidi GD3 e GM3 sono preparati tramite trattamento acido, in dimetilsolfossido, dei gangliosidi lattonizzati (1).
Sintesi di catene oligosaccaridiche. Le catene oligosaccaridiche dei gangliosidi vengono ottenute a partire dai corrispondenti gangliosidi che subiscono una reazione di ozonolisi seguita da β-eliminazione tramite trattamento alcalino (26).
Mimi degli oligosaccaridi naturali. Questi vengono sintetizzati sostituendo b-Gal-(1-4)-Glc disaccaride con un cicloesandiolo; altri mimi prevedono la sostituzione dell’ N-acetilgalattosammina e dell’acido sialico per ridurre la complessità chimica e sintetica della struttura (3-4).
Polimeri. 2-[(1-imidazoyl)formyloxy]ethylmetacrylate sarà preparato dal 2-hydroxymetacrylate and N,N-carbonylimidazole. Il prodotto verrà polimerizzato in presenza di 2,2’-azoisobutirronitrile.
Glicopolimeri. Le catene oligosaccaridi ed i loro mimi, saranno reduttaminati e direttamente, o legati in precedenza ad un braccio idrofobico di 8-18 carboni, saranno legati ad un polimero attivo. I glicopolimeri ancora attivi saranno coniugati con octadecilammina per avere un gli copolimero anfifilico.
Anticorpi ed il loro fututro. I polimeri anfifilici saranno usati per aumentare gli anticorpi monoclonali antioligosaccaridici e le loro caratteristiche saranno così definite.

Nell’arco della collaborazione con la Fondazione ho potuto sintetizzare il ganglioside GM3NeuGc (GM3 glicolil-neuramminico) presente in grandi concentrazioni nelle cellule tumorali del seno.

Ho potuto così effettuare misure di diffusione di raggi x e luce laser su soluzioni di gm3NeuGc al variare della concentrazione e della temperatura. A concentrazioni di 0.1 mM il ganglioside auto aggrega in soluzione acquosa formando spontaneamente strutture coesistenti di due dimensioni caratteristiche, una sui 70 Nm e l’altra sui 200 Nm. A concentrazioni maggiori ( fino al 5% in peso) la struttura locale degli aggregati è lamellare e al crescere della concentrazione il gm3NeuGc forma una fase organizzata sulla mesoscala, fase lamellare, con periodicità variabile con la temperatura. Questo comportamento sulla mesoscala appare diverso da quello noto per il GM3 NeuAc (ganglioside presente in cellule non affette da cancro) il cui diagramma di fase alle medesime concentrazioni e temperature non attraversa mai fasi lamellari. Questa diversità di comportamento indica peculiari proprietà di impaccamento del gm3NeuGc che possono essere associate ad un ruolo in membrana significativo in relazione alla sua presenza in cellule tumorali, eventualmente implicando differenze di comportamento rispetto al gm3 fisiologico nella signal trasduction e nelle interazioni intracellulari. Alla luce dei risultati fin qui ottenuti ho progettato di ampliare gli studi strutturali del gm3NeuGc in vitro utilizzando sistemi di membrane modello e applicando tecniche di scattering di luce, raggi X, neutroni e tecniche calorimetriche.

Maria Grazia Ciampa

Borsa di studio presso l’Università di Milano anno 213 Euro 10,000

DOTT.SSA DANIELA BARONE
Finanziamento del II anno della borsa di studio del Dottorato in Genetica, Oncologia e Medicina clinica – percorso formativo Genetica Oncologica presso Università di Siena, XXVII ciclo - Euro 16.658,87 (anno 2012/2013)

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